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proaxsis ProteaseTag主動彈性蛋白酶免疫操作指南

更新時間:2021-03-22      點擊次數:1842

proaxsis  ProteaseTag ® 主動彈性蛋白酶免疫操作指南

ProteaseTag® Active Neutrophil Elastase Immunoassay

 

免疫測定分為兩個部分:
1)一個較大的盒子[58 cm x 38 cm x 35 cm; 體重±10公斤(體重主要是由于凝膠袋)],其包含需要保持在4℃冷卻并且必須投入在接收到冰箱的液體瓶,

2)一個小的內“冷凍箱” [39厘米× 27厘米x 28厘米; 重量±7公斤(重量主要歸因于干冰)],我們在干冰上單獨發送。

因此,每個套件將[快遞]分2個單獨的包裹寄送,總重為±17公斤。

試劑盒內容物

 

冷凍箱組件

 

NE標記

1小瓶含4µl(濃度10 mM)捕獲探針

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)

人中性粒細胞彈性蛋白酶標準品

2瓶含6µl天然NE(濃度100µg/ml)的酸性緩沖液

NE結合物

1瓶含25µl

穩定性溶液中與辣根過氧化物酶(HRP)結合的抗人中性粒細胞彈性蛋白酶抗體

 

主要試劑盒組分

 

免疫分析板

96孔鏈霉親和素包被微量滴定板(預封閉)

NE清洗緩沖液A濃縮液

24 mL 25倍濃度的緩沖表面活性劑(含防腐劑)

NE洗滌緩沖液B濃縮液

8 mL含防腐劑的25倍濃度緩沖液

NE標準品稀釋劑

15 mL含防腐劑的緩沖液(即用型)

NE試劑稀釋劑

2 x 13 mL含防腐劑的緩沖表面活性劑(即用型)

TMB底物

12 mL四甲基聯苯胺(即用型)

終止液

6 mL 2N硫酸(即用型)

封板機

4個粘合條

 

需要但未提供的材料

  • 去離子水或蒸餾水
  • 經校準的移液器和相應的移液器吸頭
  • 試管和試管架
  • 清潔稀釋清洗緩沖液的容器
  • 渦旋
  • 培養箱(37 ℃)
  • 能夠在450 nm處讀數的經校準的微量滴定板讀數器

 

試劑制備

除標準品和樣品外,所有試劑均應在使用前恢復至室溫。使用前,標準品和樣品必須始終置于冰上。

提供了足夠的試劑,可獲得兩條標準曲線。

_清洗緩沖液A-用576 mL去離子水稀釋24 mL濃縮液,制成600 mL清洗緩沖液A

_清洗緩沖液B–量取8 mL濃縮液,加入192 mL去離子水中,制成200 mL清洗緩沖液B

_NE結合物–用11980µl NE試劑稀釋劑稀釋20µl NE結合物,制備12 mL結合物溶液(600倍稀釋)

_NE-Tag–用11997.6µl NE試劑稀釋劑稀釋2.4µl NE-Tag,制備12 mL NE-Tag溶液(5000倍稀釋)

_標準品-

  • 移取495µl NE標準品稀釋液至一個微量管中
  • 移取250µl NE標準品稀釋液至6個后續微量管中
  • 向試管中加入5µl NE標準品。從一個試管移取250µl至下一個試管,進行連續稀釋。轉移至下一試管前,充分混勻各試管。這將創建具有以下NE濃度的校準曲線:1000、500、250、125、62.5、31.25和15.625 ng/mL
  • 使用NE標準品稀釋劑作為零(空白)標準品

_樣品-使用NE標準品稀釋劑適當稀釋。

 

試驗程序

所有樣品和標準品均應重復測定兩次。

  1. 按照上文所述制備所有試劑、標準品和樣品。建議在加至微孔板之前立即制備標準品和樣品
  2. 從鋁箔袋中取出平板
  3. 使用300µl/孔清洗緩沖液A抽吸并清洗每個孔。重復該程序兩次,共

3次清洗

  1. 向各孔中加入100µl稀釋的NE-Tag。用封板覆膜覆蓋,并在37 ℃下孵育30 min
  2. 使用300µl/孔清洗緩沖液B抽吸并清洗每個孔。重復該步驟兩次,總計

3次清洗

  1. 向各孔中加入100µl稀釋標準品、樣品和空白。用封板覆膜覆蓋,并在37 ℃下孵育30 min
  2. 使用300µl/孔清洗緩沖液A抽吸并清洗每個孔。重復該程序兩次,共

3次清洗

  1. 向每個孔中加入100µl稀釋的結合物。用封板覆膜覆蓋,并在37 ℃下孵育60 min
  2. 使用300µl/孔清洗緩沖液A抽吸并清洗每個孔。重復該程序兩次,共

3次清洗

  1. 每孔加入100µl TMB底物溶液。用封板覆膜覆蓋,并在37 ℃下孵育10 min。避光保存
  2. 向各孔中加入50µl終止液??變阮伾珣獜乃{色變為黃色
  3. 在15 min內使用設置為450 nm的酶標儀測定每個孔的光密度。

 

結果計算

計算各標準品、對照品和樣品重復兩次讀數的平均值,并從終結果中減去零空白。通過生成log x-軸繪制標準曲線,并將曲線擬合為樣條曲線或4參數邏輯擬合。如果樣品已被稀釋,則應根據稀釋因子校正報告的濃度。

 

檢測試劑盒的局限性

正確存儲所有組件(_s)

_使用所有未開封的試劑在其有效期內

_請勿與其他批次或來源的試劑混合或替代

_所有程序均應按照方案進行

_如果樣品產生的結果高于高標準品,則應使用NE標準品稀釋劑進一步稀釋樣品并重復。

 

技術提示

_本試劑盒僅供有資質的人員使用

_按照國家和當地法規以安全方式處置容器和未使用的內容物

_為避免交叉污染,在添加各標準品、樣品和試劑之間更換移液器吸頭。此外,每種試劑使用單獨的儲液器

_為確保結果準確,在孵育步驟期間必須適當粘附封板覆膜

_囊性纖維化患者痰液或支氣管肺泡灌洗液(BALf)用NE標準稀釋液稀釋至少100倍。COPD樣本的建議起始稀釋度為10倍

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